来源 | 生物制品圈
摘要：在制药产业，基于mRNA的治疗方法，在实际应用中较为精准且可用以个体化治疗，比起重组蛋白，在患者体内产生的治疗性蛋白不会遇到复杂的生产问题，因而更具发展潜力，有可能在业内引发一场重大革命。与目前的疗法相比，生产mRNA要经济得多，且更快速，灵活，因为它可以易于通过体外转录产生，且过程与mRNA序列无关。另外，基于序列和/或个体条件，mRNA疫苗使得人们可以开发个性化疗法。随着mRNA药物从前期研发到迈向临床的潜力突显，它所面临的技术障碍也很明显。稳定性，免疫原性，转化效率和药物递送，所有这些关键问题都亟待解决。最近的研究结果表明，由于高端科技的发展，这些障碍正逐步被克服。在这篇综述里，我们阐述了mRNA结构特征和修饰技术，总结在发展mRNA递送系统的最新进展，回顾其在临床前和临床的应用。对将mRNA未来发展为一类新药的挑战和前景提出看法。信使RNA (mRNA)于20世纪60年代首次被科研人员发现，现已成为倍受瞩目的基础学科和应用研究领域。对mRNA的理解，从作为DNA到蛋白的中间物，到认为它是在所有生命器官中调节基因功能的多功能分子。基于这些变化，出现许多不同类型的基于mRNA疗法。1990，Wolff等首次报道肌内注射mRNA到小鼠骨骼肌产生编码蛋白的表达。此后，基于mRNA治疗被广泛应用，包括肿瘤免疫治疗，传染病疫苗，蛋白替换和细胞基因工程。2001，离体mRNA转染树突状细胞首次进入临床试验，过去二十年间，基于mRNA的临床试验已经开展了数百个。然而，mRNA被发现的头几十年，人们并未将其认可为一类新的药物。不稳定性和免疫原性等问题阻碍了它的发展，在基因治疗中关注热度不如DNA。最近几年，通过在mRNA序列中引入经修饰的核苷，并开发各种RNA包装和递送系统，这些关键问题基本得到解决。许多证据表明，mRNA不仅能介导更优的转染效率和更长的蛋白表达时间，而且比于DNA具有更大优势，这些优势包括：（1）mRNA无需进入细胞核即可发挥功能。到达细胞质中，mRNA即启动蛋白质翻译。相反，DNA需要先入核，然后转录成mRNA。这个过程使DNA的效率低于mRNA，因为其功能取决于细胞分裂过程中核被膜的破坏。（2）与DNA和病毒载体相比，mRNA不会插入基因组，而只是瞬时表达编码蛋白，因此，由于其低插入风险，它为研究人员和制药公司提供了绝佳的安全选择。（3）mRNA很容易通过体外转录（IVT）过程合成。这个过程相对廉价，并且可以快速应用于各种疗法。而且，mRNA在理论上能够表达任何蛋白质，因此可以使用治疗几乎所有疾病。因此，从制药行业的角度来看，mRNA是一种非常有潜力的候选药物，可以满足基因治疗，癌症治疗以及疫苗等的需求。在这篇综述中，我们总结了解决有关mRNA疗法一系列关键问题的最新进展，包括避免免疫原性，增加稳定性，提高翻译和递送效率。在传染病、肿瘤、遗传病治疗领域，对mRNA疗法候选药物的产品线和前期研发、临床研究的进展，我们也做了概述。最后，我们也对mRNA产业及其相关的生物制药企业进行了讨论。通常，天然mRNA具有单链结构，由结合在5'-末端（5'-帽）的7'-甲基鸟苷残基，和在3'端的多聚腺苷尾组成。编码蛋白质的开放阅读框（ORF）以起始密码子和终止密码子所标识，非翻译区（UTR）位于帽/尾和ORF之间。质粒DNA，PCR产物或合成的双链寡核苷酸可用作转录模板用于体外mRNA合成。转录过程由T7，T3或SP6噬菌体RNA聚合酶介导核糖核苷三磷酸进行合成互补的RNA链。在此过程或转录后，7-甲基鸟苷帽通过酶促作用在mRNA5'端进行加帽。研究表明5'帽在mRNA成熟，剪接，翻译和无义介导的降解中起着至关重要的作用。3'端多聚腺苷酸尾对于mRNA稳定性和翻译过程非常重要。然而3’-UTR 区包含α和β球蛋白序列，这些序列也能增强mRNA的稳定性和翻译效率。3'-和5'-UTR区域都能够抑制mRNA的降解和脱帽。基于裸mRNA的疗法的主要挑战之一是半衰期短，这是由于大量细胞外RNA酶迅速降解所致。体外转录的mRNA（IVT mRNA）及其蛋白产物的半衰期是影响药代动力学（PK）和药效学（PD）的关键因素。为了优化mRNA的效率，探索了对mRNA结构的各种化学修饰，包括修改5'-帽，多聚腺苷酸（A）尾部，5'-和3'-UTR以及编码区域。为了修饰mRNA的5'-帽，设计了几种帽类似物（图1）。mRNA帽由7-甲基鸟嘌呤（m7G）组成，是在转录过程中通过5'，5'-三磷酸酯桥连接到初次转录后的RNA核苷酸中。它不仅通过与翻译起始因子4E（EIF4E）结合参与翻译过程，也与DCP1 / DCP2结合调节mRNA的降解。报道最多的帽盖类似物是核糖内修饰的抗反向帽盖类似物（ARCA）m7G的部分。ARCA加帽的mRNA可防止在mRNA合成过程中错误地结合帽，因此表现出卓越的翻译效率。近来，开发了另一种帽类似物称为S类似物，三磷酸桥含有一个单硫代磷酸酯替换（O-to-S）。据报道在三磷酸桥的β位置用S替换的ARCA（β-S-ARCAs）具有两项优势：帽与EIF4E的高亲和力和对脱帽复合物DCP1 / DCP2的低敏感性。实验表明，β-S-ARCAs增强了mRNA在体内外表达编码抗原的表达，并应用于正在进行的mRNA疫苗对黑色素瘤的临床试验（Kuhn等，2010）。最近，Jacek Jemielity等，合成了一类新的帽类似物，称为2S类似物，其结合了二硫代二磷酸修饰，ARCA和延伸的多磷酸盐链。他们发现这种2S类似物提高了其在人未成熟树突状细胞中的翻译水平，并优于之前发表的用于临床试验的磷酸盐修饰的帽类似物。多聚（A）尾修饰真核生物中成熟mRNA的3'末端。它是通过转录其DNA模板或在转录后使用多聚（A）聚合酶形成。后者是有局限性的，因为多聚（A）尾的长度在不同mRNA批次生产中可能有差异，这使得对不同批次的具有确定长度的多聚（A）的可重复性变得非常困难。体外通过使用DNA模板转录多聚（A）尾，在生产制造中备受欢迎。众所周知，多聚（A）尾在调节mRNA稳定性和翻译效率方面发挥关键的作用。研究发现，在许多不同类型的细胞中，较长的尾巴都会增加蛋白表达。Mockey等发现随着的多聚（A）尾部的不断提高至100个核苷酸并结合5'ARCA cap类似物，树突状细胞中的蛋白质翻译水平持续提升。据Holtkamp等报道，相比传统的64个核苷酸的poly（A）尾，120个的蛋白质表达水平更高。然而一些专家认为，聚（A）尾并不是越长越好。他们认为适当调节多聚（A）尾巴长度对于维持细胞中特定的生物学行为非常重要，但是是否尾巴需要更短或更长，似乎是转录特异性的。mRNA中的5'-和3'-UTR包含特定的调控序列元件，可调节mRNA的翻译和稳定性。mRNA的半衰期可以通过在UTR中引入稳定性元件来进行优化。例如，α-和β-珠蛋白mRNA的3’-UTR对其超过1天的半衰期发挥关键作用。为了增加稳定性和翻译效率，许多IVT mRNA结合了α-和β-珠蛋白mRNA的3'-UTR。通过以头尾方向排列插入两个β-珠蛋白3’-UTR可以进一步提高稳定性。除了广泛应用的球蛋白UTR，各种UTR，例如人休克蛋白70，内部核糖体进入位点（IRESs）的5'-UTR和真核生物伸长因子1α（EEF1A1）的3'-UTR等都已经被纳入治疗性mRNA的研究中。对于mRNA的蛋白编码区，密码子优化导致将该序列翻译成所需蛋白质的可控性。同义密码子替换可能会对蛋白表达，折叠和细胞功能产生显著影响。因为可以从一组不同的密码子翻译相同的氨基酸，所以有多种选择来重写mRNA代码以产生完全相同的蛋白质。最近，Moderna公司的研究人员观察到mRNA二级结构可以通过改变mRNA翻译的半衰期来调节蛋白的表达，并且修饰的核苷酸可以稳定mRNA空间结构以实现蛋白的高表达水平。计算机辅助也被用于设计产生或多或少所需蛋白质的mRNA序。迄今为止，该技术已成功用于基于mRNA的疗法，例如非病毒蛋白的表达和传染病疫苗的开发。
总的来说，5'-帽，3'-多聚（A）尾巴，5'-和3’-UTR和编码区域都可以作为修饰靶标。为了获得最好的mRNA的治疗效率，有必要针对特定应用做出优化组合。IVT mRNA的一个重要问题是其免疫原性，因为外源性RNA将被视为病毒感染的信号。非免疫细胞识别RNA通过视黄酸诱导基因I（RIG-I）受体，然后触发先天免疫反应。免疫细胞可以被IVT mRNA激活并诱导通过Toll样受体引起的炎症。富含U的RNA序列是已知的Toll样受体的有效激活剂。因此，可以通过降低U的含量来解决免疫原性问题。迄今为止，可以选择几种核苷酸化学修饰策略以降低免疫原性而不影响其翻译特性。例如，将天然腺苷替换为N1-甲基腺苷（m1A）或N6-甲基腺苷（m6A）。替换天然胞嘧啶核苷为5-甲基胞嘧啶核苷（m5C）；并将天然尿苷替换为5-甲基尿苷（m5U），2-硫尿苷（s2U），5-甲氧基尿苷（5moU），假尿苷（ψ）或N1-甲基伪杜鹃碱（m1ψ）（图2）。其中，m5C和ψ备受关注，因为无论是体内还是体外都表明，它们降低mRNA的免疫原性同时也提高了翻译效率。同时研究者发现增加聚（A）尾巴的长度并减少U含量或将其隐藏在序列中会产生低的免疫原性。除了修饰核苷酸并添加多聚（A）尾巴以外，优化富含GC的密码子并使U含量最小化是另一种消除RNA免疫原性的有效方法。CureVac和Acuitas Therapeutics开发了一种无需对mRNA进行任何化学修饰的序列工程方法。他们通过给每一个氨基酸选择富含GC密码子设计了EPO的mRNA序列，并使用脂质纳米颗粒（LNP）对猪全身给药。结果表明EPO蛋白的表达导致积极的生理反应而没有可检测的免疫原性。但是，应注意GC含量不是越多越好，因为过量的GC含量不利于蛋白质表达。体外转录后，生产mRNA需要一系列纯化过程包括浓缩，沉淀，萃取和色谱法。精密的工艺技术，例如阴离子交换色谱法，大小排阻色谱柱，高效液相色谱（HPLC）和亲和力色谱法去除双链RNA和转录本的片段。这些纯化程序对消除免疫原性是必须的。据报道经HPLC纯化后具有ψ修饰的mRNA没有了免疫原性并且蛋白质翻译效率显著提高。在一个代表性的例子中，Pardi等将编码广泛中和HIV-1抗体VRC01的轻链和重链mRNA进行m1ψ修饰和HPLC纯化，并将其包裹在LNPs里。结果发现，全身给药后，mRNA-LNPs很快在小鼠中转为功能性抗体。单次注射mRNA-LNP完全保护小鼠免受HIV-1感染。安全有效地递送是开发mRNA疗法的最大挑战之一，这比递送小寡核苷酸更具挑战性。mRNA的大小（300–5,000 kDa，1–15 kb，图3a）明显大于siRNA和miRNA类似物（13-15 kDa），反义寡核苷酸（4-10 kDa）和反miR（4-10 kDa）。N-乙酰半乳糖胺（GalNAc）-寡核苷酸偶联物在体内表现出出色的肝靶向效率和安全性，但是对mRNA递送无效。由于它们的大小，电荷和可降解性，裸露的mRNA无法轻易穿过细胞膜并有效地渗入细胞质。研究证明裸露的mRNA通过清道夫受体介导的内吞途径被细胞摄入并积累在内体中。大多数细胞的摄入mRNA效率低，而未成熟的树突状细胞是例外，它可以通过巨胞饮途径摄取并有效积累mRNA。但是，治疗性mRNA的广泛应用需要更高效，更安全的递送方式，这对于实现有前景的转化疗法很关键，例如疫苗接种，蛋白质替代疗法，和基因组编辑。因此，合适的mRNA制剂，例如脂质体，多核糖体，脂质复合物和多聚体是有效将mRNA递送进入大多数类型的细胞所必需（图3b）。通常，加载mRNA的纳米颗粒是通过内吞作用摄入，然后从内体释放mRNA，溶酶体将启动翻译并产生任何类型的蛋白质，包括分泌，跨膜，胞内和线粒体内蛋白（图3c）。近年来，mRNA的体内外递送方面，各种材料，例如脂质，类脂质，聚合物，肽，蛋白质，细胞外囊泡等已被设计并探索。这些材料大多数都受到siRNA和质粒DNA传递技术的启发。代表性脂质的化学结构，脂质和聚合物基材料如图4所示。关于其成分和比例，mRNA载物，给药途径，适应症，申请者和参考文献相关详细信息见表1。脂质和脂质来源的材料是递送系统的主要组成（图4）。通过使用脂质或类脂质物质（类脂质），可以设计成各种囊泡，脂质体，脂质纳米颗粒（LNP），脂质乳剂，脂质植入物等， 例如，N- [1-（2，3-二油酰氧基]丙基] -N，N，N-三甲基氯化铵（DOTMA），1,2-二油酰氧基-3-三甲基氯化铵丙烷（DOTAP），1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE），这些作为经典的阳离子脂质，之前用于递送DNA，siRNA和mRNA。最近，BioNTech公司使用DOTMA，DOTAP，DOPE和胆固醇将mRNA递送至树突状细胞，巨噬细胞，肺内皮细胞，嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞。此项技术正在进行临床试验。先前已经对应用一系列脂质和类脂质递送siRNA进行探究，并进一步深入研究以在体内递送mRNA。这些材料包括DlinDMA，Dlin-MC3-DMA，C12-200，cKK-E12，5A2-SC8，7C1和1,3,5-triazinane-2,4,6-trione（TNT）衍生品等（图4）。基于这些关键脂质或类脂质，通过调节关键脂质与辅助脂质，PEG-脂质和胆固醇的摩尔比，改变辅助脂质或PEG-脂质，添加其他成分（例如鱼精蛋白），或使用siRNA的相同配方或优化配方，可实现有效的mRNA传递和蛋白质表达。其DLin-MC3-DMA是FDA批准的材料，还被用于FDA批准的首个siRNA治疗性Onpattro（patisiran），EC。其他几种cKK-E12衍生的类脂质，包括OF-02，OF-DegLin和OF-C4-Deg-Lin，已被证明可将mRNA传递至肝脏和/或脾脏并通过全身（静脉内）给药有效表达蛋白质。其他脂质和类脂质，包括I-DD3 / A-DD3 / B-DD3，脂质5和H，TT3，LP01，C14-113，ZA3-Ep10，MPA-A / MPA-B，C12-（2-3-2），306Oi10，ssPalm / ssPalmO-Paz4-C2和ATX-100（Arcturus的代表性脂质）（图4），已经被设计并研究用来将mRNA静脉内或局部递送至靶向组织和细胞，IntelliaTherapeutics，Ethris和ArcturusTherapeutics公司分别开发了用于研发和临床研究的mRNA递送材料：DOTMA，脂质5，LP01，C12-（2-3-2）和ATX-100。最近的一项研究中，用DOTMA-脂质复合物包裹的mRNA疫苗对T细胞生物工程化，其编码可特异性结合CLDN6的单链可变片段（scFv），靶向癌胚细胞表面抗原。功能化的CAR-T细胞在难治的小鼠模型中表现出出色的抗肿瘤作用。Moderna最近开发的DOTMALNP靶向mRNA治疗遗传性精氨酸酶缺乏症代谢性肝病，一种由（ARG1）基因突变导致的常染色体隐性代谢疾病。通过使用LNP-INT01递送系统，Intellia Therapeutics团队获得了小鼠甲状腺素基因的体内基因组编辑的临床相关水平，其包含可生物降解的可电离脂质LP01。此外，我们已经开发出一些脂质或脂质衍生的材料，并实现了有效的基因或siRNA递送。因此，我们将继续开发和研究基于脂质的mRNA递送系统，并获得出色的肝靶向mRNA递送系统。用于mRNA递送的脂质设计的原理仍有待进一步阐明。但是，有几个方面已被证明是决定递送效率和安全性的关键因素。首先，组分比和选择的磷脂对递送效率具有重要影响。尽管在某些情况下磷脂不是siRNA递送所必需的，相对较少可离子化的阳离子脂质，而更多两性离子磷脂有利于mRNA的传递。含有两性离子脂质DOPE的mRNA-LNP比含DSPC（1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱）的递送效率更高，后者常用于siRNA递送。据推测，mRNA是比siRNA更大，更具灵活性。少量可电离的阳离子脂质足以装载和浓缩mRNA，形成稳定的纳米颗粒，并且进入细胞时能有效释放。但是，大量可电离的阳离子脂质可能与mRNA紧密结合，无法在细胞中释放，这可能会导致递送效率低下。由于LNP的水囊中围绕RNA的分子间相互作用的不同，导致DOPE和DSPC的表现也不尽相同。其次，生物降解性对于功效和安全性都是重要的。如前面提到，Dlin-MC3-DMA是FDA批准的赋形剂。但是，为了进一步提高siRNA-LNP的治疗指数，通过在疏水二烷基链中添加酯键而开发的生物可降解版本L319，使siRNA-LNP能够在肝脏中快速消除。设计出ATX脂质（Arcturus），其包含可电离的氨基头基和可生物降解的脂质骨架（图4），在肝脏中降解和清除大量脂质的速度比Dlin-MC3-DMA更快。因此在非人类灵长类动物（NHP）中耐受。脂质5，一种可生物降解的可电离脂质，在疏水性尾巴之一上使用伯酯来增强肝脏清除率。此外，OF-Deg-Lin是来源于OF-02的一种可生物降解的酯，能够将mRNA输送至脾脏，而不可生物降解的OF-02在肝脏中积累并促进mRNA表达（图4）。第三，脂质饱和度显着影响细胞内mRNA的递送。据报道，随着饱和度从2个双键增加到0个，层状（Lα）到反向六角（HII）相变温度升高，表明融合性降低。DLin-DMA具有最低的相变温度，是最易融合的脂质，显示出最有效的siRNA传递效率。因此，不饱和脂质，尤其是设计成顺式-双键脂质以促进mRNA的递送。例如，基于cKK-E12设计的OF-02，通过引入不饱和脂肪链增加体内mRNA表达。据推测，类似于亚油酸的不饱和脂质尾巴，通过建立结构缺陷可以改善的细胞膜流动性，这将促进其进入细胞和内体逃逸，这两个关键因素决定最终效率。聚合物或其衍生物组成mRNA递送载体的另一大家族。线性或支链聚乙烯亚胺（PEI）是一种广泛使用的阳离子聚合物用于体内外核酸递送。也用于包装自我编码以保护人们免受病毒感染的流感病毒血凝素和核衣壳的mRNA（saRNA）。除了经典的基因递送聚合物PEI，还有许多不同的聚合物被合成以评估其mRNA递送能力。TarN3C10，DD90-C12-122，A1，C1（PBAE-PCL），氨基聚酯（APE）和由Daniel G. Anderson及其同事开发的hDD90-118，这些被用来单独使用或联合其他脂质（例如DSPC，胆固醇，14/0 PEG2000 PE或18：1 PEG2000 PE）将mRNA传递到肝细胞或通过静脉注射或吸入方式进入肺上皮，并达到理想效价和安全性结果。N5（PEH）和多胺（2-2-2-2）的聚合物通过静电作用与mRNA和核糖核蛋白形成纳米复合物，并在不同细胞中通过增强mRNA的稳定性和蛋白质合成引起高水平的mRNA转染。除上述材料外，还有另一种由Robert M. Waymouth和同事设计的可生物降解的聚合物，称为更改电荷的可释放运输器（CART）（图4，CART D13 / A11 7）。这些材料，特别是低聚物（碳酸盐-b-α-氨基酯），采用了前所未有的mRNA传递机制。寡聚（α-氨基酯）聚阳离子，它们可以非共价地络合，保护和传递mRNA，然后通过降解，电荷中和的分子内重排，以改变物理性质，导致释放有功能的mRNA和在细胞内进行高效的蛋白质翻译。TriManlip，一种三甘露糖基二醚脂质，联合Lip1（O，O-二醇基-N- [3N-（N-甲基咪唑碘鎓）丙烯]氨基磷酸酯），Lip2（O，O-二醇基-N-组胺氨基磷酸酯）和PEG-HpK（PEG化组氨酸化的聚赖氨酸），以形成脂蛋白复合物用来有效递送mRNA到树突状细胞并实现癌症治疗。此外，已有报道CP2k，aPACE，PEI10k-LinA15-PEG3.0，PEG-PAsp（TEP）-Chol，cRGD-PEG-P（Lys-MP），PEG [Glu（DET）] 2 等可通过静脉内或皮下给药将mRNA递送至肺，肝或肿瘤（图4）。以前，我们设计和评估了大量用于核酸递送的聚合物，并研究了聚合物的分子结构，聚合形式和程度，疏水核，亲水链，PEG片段，靶向部分修饰等对核酸（siRNA）递送性能的影响。各种聚合物已被进一步合成并正在评估其对mRNA递送的作用。作为一个代表性的例子，由cRGD-聚（乙二醇）（PEG）-聚赖氨酸（PLys）（硫醇）和聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）-PLys（硫醇）组成的杂化聚合物成功将mRNA递送至肿瘤组织并介导基因表达。与脂质相比，聚合物在核酸治疗中应用较少，很大程度上是由于其分子的复杂性和制造的不可控。这种情况下，简单而有效的聚合物最有可能用于临床。同时，生物降解和生物反应也是在mRNA递送方面需要考虑的关键因素。前者有利于减少毒性并增强治疗指数，而后者可能促进细胞摄取和生物反应性内体逃逸。PBAE，CART以及APE是具有代表性的生物可降解聚合物，在动物体内表现出有效的mRNA递送效率。此外，可以将靶向部分引入聚合物以增强其组织靶向性能，其中包含TriMan-Lip和cRGD-PEG-P（Lys-MP）（图4）。另一种用于mRNA转染的常用材料是鱼精蛋白，一种富含精氨酸的小蛋白。鱼精蛋白可以与mRNA紧密结合形成纳米颗粒可保护小鼠，雪貂，和猪，预防流感病毒。鱼精蛋白/ mRNA复合物也取得进展，大量的临床试验正在进行中。但是，mRNA制药公司更逐渐倾向于将LNP取代鱼精蛋白，因为前者具有更好的mRNA保护和递送效率。另外，一些其他蛋白质或肽衍生材料，例如OM-PBAE，RALA以及细胞外囊泡，病毒样颗粒，壳聚糖-海藻酸盐凝胶支架，氟化类肽晶体，DNA修饰的金纳米颗粒和聚阳离子官能化锆（Zr）基金属有机骨架（MOF）已被证明可用于体内/外mRNA转运。几种聚合物或基于脂质的商业转染试剂，例如体内jetPEI™，Lipofectamine™，MegaFectin™，Stemfect™和TranslT™也是能够浓缩和装载mRNA，保护其载物免于降解并在体内外运输进入细胞。与其他递送系统相比，纳米大小的制剂具有许多优点，例如易于制造，批次之间的差异性小，良好的生物相容性和可扩展性。另外，一些脂质体和多核糖体可通过偶联化学基团与特定的细胞或组织配体实现功能化。近来，这些纳米颗粒或纳米结构已被广泛用于基于mRNA的癌症免疫治疗，抗病毒疫苗和在特定组织中功能性蛋白的表达。除了递送系统，对特定组织或疾病选择合适的注射方式对于确保成功递送mRNA也是重要的。电穿孔和显微注射通常用于mRNA体外内转染。一些临床前和临床研究用以评价通过电穿孔对IVT mRNA或患者来源的mRNA治疗癌症免疫疗法（表2）。静脉注射裸露的mRNA可以激活先天免疫系统，这表明该技术可以应用于需要免疫反应和相对少量的编码蛋白。它可能那种需要替换大量蛋白质疗法的其他临床应用。但是，当联合递送介质形成制剂后，mRNA可以通过多种途径给药，例如静脉内，皮下，皮内，肌内，肿瘤内，鼻内，腹膜内，气管内和眼眶后注射。至今，已经进行了数十项临床前和临床开发以研究不同的mRNA给药途径在传染病，癌症和蛋白质缺陷疾病领域。根据正在进行的临床试验信息（见网址http：//www.clinicaltrials.gov），mRNA治疗主要应用于以下领域：癌症免疫疗法，专门用于基于mRNA的树突状细胞（DC）疫苗。在诱导潜在的免疫反应中，DCs发挥着关键的作用，他们能指导细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤细胞，形成强大的抗肿瘤武器，能够攻击肿瘤细胞。对于基于mRNA的DC疫苗，IVT mRNA和自体肿瘤干细胞衍生的mRNA用于为DC加载肿瘤特异性抗原。mRNA可以在离体或细胞原位将DCs工程化。对于离体方式，将病人身上分离的前体DC激活形成成熟的DCs，其装载编码抗原的mRNA并被再次注射到病人体内。有几种方法可以应用于DC的抗原加载，包括核转染、脂质体转染、超声和电穿孔法，其中电穿孔是一种常用的技术。对于DC分化最常用的是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合IL-4 。GM-CSF能有效的刺激免疫系统。它能在注射部位招募免疫效应细胞并促进抗原递呈。DC疫苗与GM-CSF佐剂和mRNA，已被用于几个临床试验(NCT03396575、NCT00204516、NCT00204607、NCT00626483等)。树突状细胞的成熟状态对疫苗接种至关重要，树突状细胞表达高水平的共刺激表面标记物，从而产生更好的治疗效果。然而，也有相反的报道，mRNA摄取和随后抗原表达仅发生在未成熟的树突状细胞中。除了成熟状态，DCs产生IL-12p70的能力，一种重要的驱动向TH1分化的细胞因子，被证实影响DC疫苗的临床反应。IL-12p70的产生可以通过TLR配体或促炎细胞因子刺激DCs来实现。对于DC的原位转染，普遍的做法是将编码抗原的mRNA直接注射到淋巴结或与TriMix共递送。这两种方式都在进行临床试验。例如，结节内注射的针对晚期黑色素瘤的I期临床试验（NCT01684241）已完成。TriMix是三种mRNA的混合物，编码免疫调节剂CD40L，CD70，截短的组成性表达活化的TLR4。据报道，这种所谓的TriMix平台表现出比其他经典刺激性细胞因子复合物更高的刺激能力，以及增强了效应T细胞的扩增能力。后者包括由IL-1β，TNF-α，IL-6和前列腺素E2组成的复合物以刺激DC。尽管裸露的mRNA能够激活TLR并诱导DC激活，但这过程不足以完全激活DC的抗原递呈能力。用刺激剂（例如TriMix）是一种有效递送编码抗原的mRNA的方式。2010首次实施了用于晚期黑色素瘤治疗的TriMix-DC疫苗（NCT01066390）。之后TriMix-DC疫苗联合检查点抑制剂ipilimumab的组合取得了令人鼓舞的结果（NCT01302496）。Boczkowski等首次报道经编码肿瘤抗原的mRNA刺激后，DC诱导强效抗原呈递能力并在小鼠体内抑制肿瘤生长。之后，肿瘤相关抗原的可用性提高了，如癌胚抗原（CEA），人类端粒酶逆转录酶（hTERT），前列腺癌相关抗原（PSA），Wilm'stumor-1（WT1），gp100，MUC1，酪氨酸酶和survivin等，mRNA的临床前和临床研究数量就像现成的抗癌疫苗得到蓬勃发展（表2）。例如，安特卫普大学医院发起了多项临床试验，以研究自体DC中装载了编码WT1抗原的mRNA在癌症治疗中的作用（NCT02649829，NCT02649582，NCT01291420，NCT01686334，NCT01686334）。患者来源的hTERT和survivin mRNA加载到DC中，疫苗治疗以根治性前列腺癌的治愈性患者正处于处于临床I/II期中（NCT01197625）。DC疫苗的给药途径对DC的分布有重要影响。DC的几种给药途径已在临床试验，例如静脉内，皮下，皮内，结内和肿瘤内给药，其中皮内给药最常使用。这是因为在皮肤的不同层中有多种类型的免疫细胞，包括朗格汉斯细胞，T细胞，皮肤DC和浆细胞样的DC。一些研究表明静脉注射DC疫苗对其淋巴结迁移的效果较差。其他研究表明，与皮内注射mRNA相比，淋巴节间注射mRNA表现更高效地诱导抗原特异性T细胞反应，这是由于淋巴结常驻DC能快速有效吞噬mRNA。但是，越来越多的证据证明，对于何种DC注射途径更优越的争论很重要。组合不同的给药途径可能对于诱导全身性免疫反应是个好的选择。除了DC以外，mRNA还被转染到其他免疫细胞中以产生癌症疫苗，例如朗格汉斯细胞（LC），细胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤（NK）细胞。LC是皮肤中DC的一类。多项研究表明，LC在诱导细胞毒性淋巴细胞（CTL）反应方面非常显著。使用基于LC的癌症疫苗进行黑色素瘤或骨髓瘤治疗的临床试验正在进行中（NCT01995708，NCT01456104）。此外，可以通过对T细胞和NK细胞转染编码嵌合抗原受体（CAR）的mRNA，促进抗原结合和细胞激活，从而识别并杀死在细胞表面表达这些抗原的肿瘤细胞。据报道，CAR策略在几种动物肿瘤模型中均有效，并且已进入临床试验（NCT01355965，NCT03415100）。通过对正在进行的用于肿瘤免疫治疗的mRNA疫苗的临床试验研究，我们发现DC疫苗与其他抗肿瘤疗法联合的应用正在增加，例如化学疗法，siRNA，细胞因子和抗体等（NCT00672542，NCT02649829，NCT03396575）。据Anguille等报道，联合疗法基于三种主要机制：增强免疫反应，保持肿瘤相关的免疫抑制，减少肿瘤负担并增加肿瘤细胞的免疫敏感性。合理使用DC疫苗联合其他疗法可以提高整体疗效的治愈率。传染病的疫苗接种是mRNA治疗的广泛应用领域。一些基于mRNA的应对传染病的疫苗正在研究中，以治疗诸如流感，狂犬病，HIV，寨卡病毒感染等疾病。在这些mRNA科技公司中，Moderna，Inc.拥有最多的开发传染病疫苗的产品线，主要基于其LNP平台。他们的H10N8流感疫苗，一种用LNP配制的经修饰的mRNA疫苗，可编码病毒抗原蛋白血凝素（HA），已在健康志愿者中进行I期临床研究（NCT03076385）。数据显示100μg肌内注射剂量可以诱导高水平的免疫原性，并且安全且耐受性良好。人巨细胞病毒（CMV）是新生儿感染的主要原因。它会导致严重的并发症，例如耳聋，小头畸形，视力减退和精神缺陷等。目前针对CMV感染尚无批准的疫苗。最新公布的数据显示Moderna的编码CMV糖蛋白gB和五聚体复合物（PC）的mRNA疫苗在免疫小鼠和NHPs中产生有效且持久的中和抗体滴度。目前该疫苗正在进行I期临床试验（NCT03382405）。另一种由LNP配制的Moderna的编码病毒抗原蛋白（寨卡病毒prM和E）Zika mRNA疫苗目前正处于针对健康志愿者的I / II期临床研究中（NCT03014089）。感染寨卡病毒的母亲所生的孩子病毒患有小头畸形，这是一种严重的疾病，其特征是异常小头部和严重的神经系统残疾。目前没有更多治疗选择或没有经批准的针对寨卡病毒感染或先天性寨卡综合征的疫苗。在小鼠的研究显示Zika mRNA疫苗可防止子宫内感染小鼠寨卡病毒并保护胎儿免受寨卡相关的先天性损害。这是首次在怀孕期间预防寨卡病毒疫苗的研究。到目前为止，一些mRNA传染病疫苗正在进行临床试验，主要是狂犬病，艾滋病毒，CMV，流感和寨卡疫苗（表2）。更多的临床前研究正在进行中，成功的前景是光明的。mRNA最普遍的应用之一是治疗性抗体和功能性蛋白的引入，这些蛋白是由于基因突变导致的错误表达或功能丧失。尽管这些概念已经提出了几十，mRNA分子最初并不被看好。最近几，先进的技术，例如核苷的化学修饰，精制的纯化过程和新的递送策略已在很大程度上克服了这些缺点。mRNA介导的转录替代疗法可应用于产生功能性的囊性纤维化跨膜转导调节剂（CFTR）蛋白，在CF患者中此蛋白有缺陷。在体外研究中，野生型CFTR mRNA被转染到原代培养的人鼻上皮中（HNE）细胞和人支气管上皮细胞，其表达水平几乎增加了两倍，大量CFTR位于细胞膜中。Translate Bio的CF mRNA治疗目前正在进行I期临床研究，使其成为第一家进行mRNA介导治疗人类罕见遗传疾病的公司（NCT03375047）。Moderna公司目前正在探索通过肺部mRNA递送来治疗CF。目前，大多数基于mRNA的基因治疗均在临床前研究中。2016，阿斯利康和Moderna启动了AZD8601的一期临床试验（基于mRNA的研究性疗法，编码血管内皮生长因子A（VEGF-A）。之前，科学家注射了编码VEGFA的mRNA直接靶向小鼠的心脏。他们发现这种mRNA可以产生足够的蛋白改善心脏病发作后动物的生存和健康。20185月1日，对AZD8601进行了一项随机，双盲II期临床试验，在中度收缩功能受损的冠心病患者进行动脉旁路移植术，研究心外膜注射后的安全性和耐受性（CABG）（NCT03370887）。这是迄今为止Moderna公司进展最快的一个项目。mRNA翻译的蛋白质通过一系列过程可以转化为治疗性蛋白质，包括折叠，翻译后修饰，聚集成分泌颗粒，并转运到细胞外部。在这些过程中多种因素可能会影响蛋白质的最终生理作用。例如，信号肽在指导蛋白质分泌中起着重要作用，广泛应用于改善在细胞中的蛋白表达。理想情况下，胞外mRNA应被转染到那些天然分泌编码蛋白的细胞中，否则需要优化信号序列。另一个应该考虑的主要因素是IVT mRNA的细胞或组织特异性递送。不同细胞的翻译后修饰具有差异。例如，糖基化，蛋白水解，辅因子依赖性折叠和错误折叠蛋白的清除在异源组织中是细胞依赖性的。除此之外，与长期基因治疗（如质粒DNA转染）相比，mRNA递送导致蛋白质表达的持续时间较短，有时，这被认为是mRNA治疗的局限性。然而，在重复给药的情况下，通过瞬时表达治疗性蛋白，可以治疗许多病理缺陷。另外对mRNA药代动力学和药效学特征的理解，以此来指导其使用剂量是必需的。基于mRNA的疗法的另一个有前景的方向是使用mRNA对细胞进行编程和重塑。多能诱导干细胞（iPSCs）为建立疾病模型，再生医学和组织生物工程提供了潜在的细胞来源。已成功应用基于DNA和RNA的技术用于转染体细胞以产生iPS细胞。而使用IVT mRNA显示出更快的基因表达，并能够产生无整合的临床相关iPSC。到目前为止，基于RNA的技术应用于细胞重编程和谱系转换仍处于实验室研究阶段。围绕mRNA的主要考虑因素，例如细胞毒性，免疫原性和转染效力等已经做了许多尝试。沃伦等通过转染经化学修饰的编码KLF4，c-MYC，OCT4，和SOX2因子的mRNA进入体细胞实现对其重新编程为多能细胞。吉冈等报告了另一种基于委内瑞拉马脑炎重编程因子（VEE-RF）RNA的方法。VEE-RF RNA复制子表达了四个重编程因子。通过单次转染VEE-RF RNA到人成纤维细胞中可以有效产生iPS细胞。这些基于mRNA的iPS细胞重编程技术可能有很大的机会被转入到临床应用。IVT mRNA也可用于指导iPSC分化为终末分化的细胞。Warren等也证明了这一点。将MYOD1 mRNA重复转入iPSC，可将其转分化为终末分化的成肌细胞。此外，研究人员和生物技术公司也注意到使用治疗性mRNA为那些不需要的，患病的细胞编程以合成胞内毒素，从而诱导细胞自杀。Moderna公司设计了一种编码毒素蛋白的mRNA，在其3’UTR含有两个不同miRNA结合位点（miRts）。经LNP包裹和肿瘤内注射mRNA后，在肝细胞癌细胞（HCC）中表达了大量的毒性蛋白诱导细胞凋亡，但在健康的肝细胞中毒性蛋白的表达是有限的。这是因为不同的miRNA通过mRNA被募集到HCC和健康肝细胞中，大量的miRNA通过小干扰RNA的机制降解正常的肝细胞中的mRNA。其他募集的miRNA142在造血细胞中丰富，导致许多抗原呈递细胞中的蛋白质表达受到抑制。miRNA介导的特洛伊木马为mRNA治疗中缓解脱靶表达和免疫反应提供解决方案。使用工程化的核酸酶精确敲入或敲除缺陷基因使得基因编辑技术在治疗遗传性疾病方面前景广阔。这些核酸酶包括锌指核酸酶（ZFN），转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）和RNA引导簇规则间隔短回文重复（CRISPR/CRISPR相关蛋白（Cas）内切核酸酶。迄今为止，已经成功进行了DNA质粒载体介导的编辑。但是质粒介导的核酸酶持续表达是把双刃剑，缺点是持续表达的核酸酶增加了基因编辑的脱靶机会。对此，由mRNA编码ZFNs，TALENs，Cas内切酶似乎是一个不错的替代方案，因为其表达是瞬时的。近年来，mRNA编码基因编辑工具已被广泛用于人原代细胞和转基因动物的构建。CRISPR / Cas9是最常见和最简单的系统之一，用来产生修饰携带动物的基因组。例如，通过显微注射或电穿孔将Cas9 mRNA和指导RNA（gRNA）转入受精卵中，成功地产生了大规模的突变小鼠。其他Cas核酸酶，例如Cpf1，也已经被应用于产生基因敲除小鼠。在概念验证研究中，通过新型两性离子氨基脂质（ZAL）递送系统将Cas9 mRNA（≈4500nt）和sgRNA（≈100nt）静脉注射到小鼠体内，以诱导靶向DNA编辑。这种非病毒RNA递送系统提供了体内基因编辑的强大工具。通过电穿孔将ZFN mRNA和腺相关病毒（AAV）血清型6载体转入人类造血干细胞，祖细胞（HSPC）和T细胞，也可以有效的实现对这些细胞的基因组编辑。但是，向临床医学转化中，基因编辑技术的安全性和有效性应引起重视。因为一项对造血干细胞和祖细胞的基于CRISPR / Cas9-AAV6基因编辑的研究发现Cas9 mRNA激活了转录变化，引起病毒反应和整体转录下调。基于mRNA有望成为治疗遗传病、癌症、传染病及其他疾病的强效疗法，市面上成立了越来越多资金雄厚的生物技术公司涉足该领域，例如Moderna，CureVac，BioNTech，Argos Therapeutics，RaNA，Translate Bio，Ethris，Arcturus，Acuitas等。这些公司在技术方面实现了一些突破，但关于mRNA递送、脱靶和免疫原性这些关键问题，依旧未能完全解决，将mRNA转为上市药物还有很长的路要走。对于蛋白质替代疗法，其剂量需要仔细考量，因为相同剂量的mRNA所产生的蛋白量可能因人而异。筛选那些编码有效蛋白的候选mRNA是合理的，这些蛋白应该在低剂量下具有较宽的治疗窗口。因此癌症免疫疗法和传染性疾病的疫苗首选是mRNA。对于癌症免疫疗法，对mRNA抗原的选择可能是一个大问题。例如，mRNA-4157（Moderna）由20个mRNA组成，是通过源自患者肿瘤和血液的基因测序筛选得到。筛选新抗原并预测其产生足够免疫反应潜力的技术仍在开发中。重要的新抗原有可能被研发人员错过，被选中的反而是低效或脱靶的抗原，这都会导致安全问题。肿瘤组织中的突变克隆可能差异很大，因此很难确定需要多少抗原才能产生足够的抗原免疫应答。另一挑战是将mRNA递送到细胞中并促使其从内体释放。mRNA长度跨越数百至数千个核苷酸，并且比其他种类的RNA药物更大（例如siRNA）。因此需要设计新的递送系统。而更大的长期挑战将是mRNA的组织选择性。常用的LNP倾向于在肝脏中富集，从而使mRNA可用于肝靶向治疗。然而，mRNA传递到其他器官需要适当的给药途径，例如阿斯利康（AstraZeneca）对心脏病发作的临床试验是将VEGF mRNA通过心外膜注射或一个智能递送系统给药。另一个值得注意的问题是mRNA公司的透明度，包括先进技术和专利公开。这些公司通过向私人投资者持续筹集资金，但很大程度上对其科学细节有所保留。科研数据可能只有投资者得看到，局外人只能猜测。过去二十年里，在人类药物研发过程中，mRNA领域一直涉足甚少。现在这一领域吸引了数十亿美元的投资。与传统蛋白药物相比，mRNA的生产周期更短，成本更低且更容易控制污染。RNA疫苗还避免了与DNA疫苗相关的几个问题。此外，mRNA的两个最令人关注的问题是免疫原性和稳定性，在对选定的核苷酸进行化学修饰后这些问题得到一定程度的控制。随着其他RNA药物（ASO和RNAi）获得批准，一旦发布更多的积极数据，mRNA研究领域会变得更热门。短期内mRNA可能存在很多问题，但长期来看，这绝对是值得探索的。https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2020.107534
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